本发明公开了一种利用粉红粘帚霉－转基因植物体系修复重金属、有机物污染土壤，特别是修复重金属-有机物复合污染土壤的方法。其特征在于：将可增强植物有机污染修复效率的外源基因和可提高植物对多种金属耐受力和积累量的外源基因引入植物，构建一种对重金属污染、有机物污染，特别是对重金属－有机物复合污染都有较好修复作用的转基因植物；在种植转基因植物同时，施用粉红粘帚霉，形成粉红粘帚霉－转基因植物体系，从而高效修复被污染土壤。本发明对于以下三种类型的污染土壤都有较好的修复作用:(1)有机污染物如多环芳烃，三氯乙烯、二溴乙烷等卤代烃化合物污染土壤；(2)多种重金属如Cd、Cr、Cu、Mn、Zn及Pb等污染的土壤；（3）重金属-有机物复合污染土壤。其过程包括：转基因植物的构建，阳性植株的筛选及培养，建立粉红粘帚霉－转基因植物体系，进行污染土壤的修复。本发明在重金属污染、有机物污染、重金属-有机物复合污染的土壤修复中具有广阔的应用前景。
1.一种利用转基因植物－粉红粘帚霉体系修复污染土壤的方法，其特征在于在污染土壤中种植转基因植物并施用粉红粘帚霉，建立转基因植物－粉红粘帚霉体系用以修复被污染土壤；所述的粉红粘帚霉（Clonostachysxa0rosea）是一种广泛存在于土壤中的植物病原真菌的重寄生菌，具有植物促生作用，可以促进植物生长发育，提高植物耐旱耐涝、耐高、低温能力，还有较好的生物防治能力，为非致病菌；施用粉红粘帚霉的方式是施用粉红粘帚霉孢子粉剂；粉红粘帚霉分生孢子和厚垣孢子均可施用；施用粉红粘帚霉孢子粉剂的方法有两种：（1）、在转基因植物苗根部区域施用粉红粘帚霉孢子粉剂，使根部区域的孢子浓度为10^3-5孢子/克土壤；（2）、用粉红粘帚霉孢子粉剂拌转基因植物种子，拌种用孢子粉剂的孢子浓度为10^3-5孢子/克；所述转基因植物是将可增强植物有机污染修复效率的外源基因和可提高植物对多种金属耐受力和积累量的外源基因引入植物，从而获得可修复重金属和有机物复合污染土壤的转基因植物；所述可增强植物有机污染修复效率的外源基因和可提高植物对多种金属耐受力和积累量的外源基因如下：来源于哺乳动物的金属硫蛋白（MT）基因、来源于高等植物的类MT基因或者来源于哺乳动物的细胞色素P450u30002E1基因、1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨基酶基因或γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因（γ-ECS）；所述的有机物为多环芳烃（PAHs）、三氯乙烯或二溴乙烷；所述的重金属为Cd、Cr、Cu、Mn、Zn和Pb；所述的污染土壤为重金属污染的土壤、有机物污染的土壤或重金属-有机物复合污染的土壤；所述的转基因植物为烟草、花椰菜、紫花苜蓿或印度芥菜。技术领域
本发明涉及生物技术及环境保护领域，特别是涉及一种用转基因植物－粉红粘帚霉体系修复重金属、有机物污染土壤，特别是重金属-有机物复合污染土壤的方法。
背景技术
随着城镇化、工业化、汽车尾气排放以及农业的集约化发展,环境问题越来越受到人们关注,重金属、有机物引起的土壤污染也日益成为环境、土壤科学家们研究的热点问题。土壤被重金属及有机物污染后,不仅直接影响作物产量和品质,还会通过食物链影响人体健康和安全。利用绿色植物清除污染物的策略,xa0即植物修复技术具有成本低,xa0环境友好和可再利用等特点,xa0是一种非常有前途的环境污染原位治理途径。转基因植物由于具有更好的耐受力和积累量，可以得到更好的土壤修复效果。用转基因植物修复污染土壤，已经成为各国科学家研究的重点之一。
发明内容
转基因植物－粉红粘帚霉体系粉红粘帚霉（Clonostachysxa0rosea）是一种广泛存在于土壤中的植物病原真菌的重寄生菌，可以促进植物生长发育，提高植物耐旱耐涝、耐高、低温能力，对贫瘠土地的植物生长有较好促进作用，且具有较好的生物防治能力，为非致病菌。粉红粘帚霉对人、畜无毒无害，可防治多种蔬菜病害，是一种很有价值的绿色生物农药。本发明主要应用了粉红粘帚霉的促生作用。复合污染对植物造成严重的损害和生长抑制，所以，本团队提出，在种植转基因植物的同时施用粉红粘帚霉，以形成转基因植物－粉红粘帚霉体系，可望大幅度增强转基因植物对复合污染的耐受性和累积能力，从而大幅度提高转基因植物对复合污染土壤的修复能力。本团队的实验已经证实，用转基因植物－粉红粘帚霉体系可以显著增加转基因植物的修复能力。尽管目前还未见粉红粘帚霉用于污染土壤修复的报道。本团队自己生产了粉红粘帚霉孢子制剂，可以用于污染土壤的修复。同时，也可从市场上购买粉红粘帚霉孢子制剂，用于修复污染土壤。2.2xa0转基因植物修复重金属污染在转基因植物修复中，植物鳌合肽技术得到较多应用。美国的Bennett等分别比较了表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（ECS）或谷胱苷肽合成酶(GS)或ATP硫酸化酶（APS）基因的印度芥菜对土壤的修复效果，结果表明，表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（ECS）或谷胱苷肽合成酶(GS)的植株，植物鳌合肽和谷胱苷肽的水平增加，对镉的耐受力和积累量也提高。表达ATP硫酸化酶的植株，其谷胱苷肽和硫醇的含量均有所提高。ECS和GS植株茎叶的重金属累积量显著高于野生株，其中镉为1.5倍，锌为1.5－2倍，对于铬、铜、铅，ECS植株的累积量为野生株的2.4－3倍。所有的转基因植株从土壤中清除的重金属量均显著高于野生株，土壤中镉、锌的减少量分别为25％和6％。上述几种转基因植株中，ECS植株的表现最佳。Li等将γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（ECS）基因在拟南芥中表达，使谷胱甘肽在茎叶和根中的含量较野生株增加了2－5倍，有效提高了植物对砷、汞的耐受力。Pomponi教授等将拟南芥的植物鳌合肽基因在烟草中表达，提高了植株对Cd的耐受性和积累量。xa02007年，美国的Banuelosxa0等将半胱氨酸裂合酶（cpSL）和半胱氨酸转甲基酶（SMT）基因分别转入印度芥菜中表达，用转基因植株修复硒污染的土壤。结果，春季种植的转cpSL基因的植株对硒的累积量增加到原来的2倍，与野生型植株相比，叶子中硒浓度提高了1.8倍。转SMT基因的植株叶子中硒浓度比野生型植株提高了1.7倍。xa0秋季种植的转SMT基因的植株对硒的累积量是野生植株的1.6倍，且茎、叶中硒的浓度都较高。这些结果表明，cpSL、SMT的转基因印度芥菜对硒的累积能力显著提高。xa0LeDuc等研究者分别在拟南芥和印度芥末中同时表达ATP硫酸化酶和半胱氨酸甲基转移酶，使植株对硒的积累量提高了4－9倍。Banuelos等研究者进行了转基因印度芥菜的大田试验，在转基因植株中表达了半胱氨酸裂合酶或半胱氨酸甲基转移酶,结果表明，硒的积累量提高了1.6－2倍。Gasicxa0等将拟南芥的植物鳌合肽基因在印度芥菜中表达，提高了植株对镉的耐受性。除了鳌合肽技术外，其它的转基因植物也用于重金属污染修复。日本的Yazakixa0K等异源表达哺乳动物的ABC转运器基因于烟草中，可以同时提高对有机和无机污染物的耐受性，因而，可望用于复合污染的植物修复。但是，ABC表达的不够稳定。Sasaki等在拟南芥中表达细菌汞转运蛋白基因，构建了超级汞积累植株。Kimxa0等在拟南芥中表达ABC转运器AtPDR8,提高了对镉的耐受力。2006年，美国的Lindblom等将高亲和的硫酸盐传输子基因在印度芥末中表达，明显提高了植株对Cr,xa0Cd,xa0V和xa0W的耐受力。日本科学家Sasakixa0等将硫杆菌的汞膜转运蛋白在拟南芥中表达，构建了超级耐汞植物，其汞积累量为野生植物的2倍。Nagata等将细菌磷酸激酶基因在烟草中表达，提高了植株的汞耐受性和积累量。转基因植物修复有机物污染三氯乙烯（TCE）等是污染量较大的有机污染物，特别是对地下水的污染较多。细胞色素P450xa02E1酶可以氧化多种污染物，包括三氯乙烯、溴乙烯、氯仿、四氯化碳及氯乙烯等，对多种主要的土壤污染物有效,xa0因此P450xa02E1xa0(CYPxa02E1)xa0被认为是增强植物有机污染修复效率的候选基因。美国科学家Doty等将人类细胞色素基因P450xa02E1转入烟草，用其修复污染土壤。P450xa02E1转基因烟草对TCE的代谢能力较空白对照株提高达640倍。转基因植株明显增加了对溴乙烯的摄取和脱溴作用。所以，P450xa02E1植株可用于卤化物污染的植物修复，有效修复卤化物污染。2006年，xa0Rylottxa0等在拟南芥中表达降解环三甲撑三硝胺(RDX)的细胞色素P450,提高了其对RDX的耐受力，在含RDX环境中，茎叶及根的生长均优于野生植株。希腊学者Karavangelixa0等构建转基因烟草，表达玉米的谷胱苷肽转移酶基因，提高了对对氯乙酰苯胺除草剂的降解能力。将细菌氯儿茶酚双加氧酶基因在拟南芥中表达，转基因拟南芥表现出明显高的清除儿茶酚的能力，可以用作芳香污染物的植物修复。同时表达多个基因可产生协同作用。Inuixa0H等在马铃薯中表达人类P450基因：CYP1A1,xa0CYP2B6,xa0CYP2C9xa0和xa0CYP2C19。结果表明,同时转入CYP1A1,xa0CYP2B6,及CYP2C19基因的植株T1977,表现出对多种除草剂的交叉抵抗力；表达CYP2C19基因的植株2C9-57R2,xa0对磺脲类药物有较强耐受力；表达CYP2C9基因的植株2C19-12R1,xa0对多种除草剂有较强的交叉耐受力。上述结果表明多基因协同作用，提高了转基因马铃薯的修复能力。Kawahigashi等采用质粒pIKBACH，将人类细胞色素P450的基因xa0CYP1A1,xa0CYP2B6,和CYP2C19同时在水稻中表达，大幅度提高了水稻对除草剂莠去津和异丙甲草胺的耐受力，可以对有机污染的土壤进行植物修复。Wawrzynskixa0等将丝氨酸乙酰转移酶基因、γ-谷氨酰半胱氨酸酶基因和植物鳌合肽合成酶基因同时在植物中表达，使镉的积累量提高8倍，而表达单一基因的植株，镉的累积量提高较少。这表明，同时表达多个基因，具有协同作用。美国专利20060150279A1，将鼠李糖基转移酶基因rh1A或xa0rh1B，或2个基因同时表达于烟草中，增加了转基因植株对铜等污染物的耐受力。美国专利20060130173A1，将P型xa0ATPasexa0ZntA基因转入拟南芥，提高了植株对重金属的耐受力。美国专利20060095982A1，在植物中表达植物鳌合肽，提高了植株对污染土壤的修复能力。中国专利CN1594583，将iaaM基因和1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨基酶基因在矮牵牛或烟草中表达，提高了转基因植物对铜、铅、镉、钴等不同重金属的广谱富积特性和抗性。复合污染修复xa0xa0xa0xa0[0010]土壤污染可以分为单一污染和复合污染。单一污染如重金属污染、有机污染物污染；而复合污染是指同时有重金属和有机物造成的污染，其修复难度最大。许多地区存在重金属和有机物的复合污染，复合污染带来更严重的影响，因此修复复合污染的任务更加艰巨。目前的转基因植物，只是转入了针对重金属污染或者有机物污染的相应基因，因此，只能用于单独修复重金属污染或者有机物污染，而不能修复复合污染，因此，将可以修复重金属污染和有机污染的相应基因同时在一个植株中表达，使其同时大幅度提供对重金属和有机污染物的耐受力及累积量，成为修复复合污染土壤的有力工具。能够修复复合污染土壤的体系，更能修复单一污染的土壤，因为单一污染土壤的修复难度较低。三、发明内容本发明基于以上背景，在植物中引入增强植物有机污染修复效率的外源基因和可提高植物对多种金属耐受力和积累量的外源基因，获得一种对重金属和有机物都有较好修复效果的转基因植物，并在种植转基因植物的同时施用粉红粘帚霉，以形成转基因植物－粉红粘帚霉体系，为重金属、有机物污染土壤，特别是重金属-有机物复合污染土壤的高效修复提供了一条有效的途径。本发明的目的在于提供一种利用转基因植物－粉红粘帚霉体系修复重金属、有机物污染土壤，特别是重金属-有机物复合污染土壤的方法。本发明的目的可以通过如下步骤实现：3.1.将外源基因引入植株（1）构建含有可增强植物有机污染修复效率的外源基因和可提高植物对多种金属耐受力和积累量的外源基因的双元表达载体（2）利用电转化方法将所构建的植物双元表达载体转化农杆菌（3）通过农杆菌介导法将外源基因转入植株3.2、转基因植株的筛选u3000u3000[0014]在施加抗生素选择培养基上进行分化培养和诱导生根培养，筛选出抗性再生植株。3.3、转基因植株的检测分析（1）转基因植株的PCR检测（2）转基因植株的酶切及Southernxa0杂交检测（3）Western印迹法对外源基因的表达产物进行检测3.4、建立粉红粘帚霉－转基因植体系，进行复合污染土壤修复实验。粉红粘帚霉为活菌制剂，施用粉红粘帚霉的方式是施用粉红粘帚霉孢子制剂，特别是施用粉红粘帚霉孢子粉剂，粉红粘帚霉分生孢子和厚垣孢子均可施用。建立粉红粘帚霉－转基因植体系的方式有以下两种：（1）在转基因植物苗根部区域施用粉红粘帚霉孢子粉剂，使根部区域的孢子浓度为10^3-5孢子/克土壤；（2）用粉红粘帚霉孢子粉剂拌转基因植物种子，拌种用孢子粉剂的孢子浓度为10^3-5孢子/克。所用的粉红粘帚霉孢子，可以从市场上购买，也可以自行生产。本发明所用的粉红粘帚霉孢子为自行生产。施用了分生孢子和厚垣孢子，其中厚垣孢子的生产方法详见中国发明专利，专利号：ZL201110024322.6。实验表明，施用分生孢子（生产日期在6个月以内）和厚垣孢子（生产日期在一年以内）的效果是相近的。用铅和多环芳烃进行了复合污染土壤的转基因植物盆栽修复实验，实验表明，当铅浓度为1000mg/kg;xa0多环芳烃为1000mg/kg时，野生植株不能生长，转基因植株生长受到明显抑制，而施用粉红粘帚霉孢子粉剂后，转基因植株生长良好，其对复合污染土壤的修复能力远远强于没有施用粉红粘帚霉孢子粉剂的植株。由于粉红粘帚霉具有很好的促生抗逆作用，且转双基因植物的抗复合污染能力较强，当两者结合，组成一种很强的促生抗逆体系后，形成意想不到、很强的协同效应，显著增加修复重金属、有机物污染土壤，特别是修复重金属－有机物复合污染土壤的能力。本发明的优点在于：(1)xa0xa0将可增强植物有机污染修复效率的外源基因和可提高植物对多种金属耐受力和积累量的外源基因在植物中同时表达，可进一步提高植物对重金属和有机物的耐受和积累能力。在施用粉红粘帚霉孢子粉剂后，由于形成粉红粘帚霉－转基因植体系，从而产生了显著的协同效应，收到了意想不到的效果，大幅度增加了修复能力。(2)xa0xa0本发明的粉红粘帚霉－转基因植体系可用于多环芳烃（PAHs），三氯乙烯、二溴乙烷等卤代烃化合物等有机物污染土壤的修复(3)xa0xa0本发明的粉红粘帚霉－转基因植体系可用于Cd、Cr、Cu、Mn、Zn和Pb等多种重金属污染的土壤的修复；(4)xa0xa0本发明的粉红粘帚霉－转基因植体系可用于上述重金属和有机物造成的复合污染土壤的修复。显然，本体系也能更好的修复单一污染的土壤。下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
具体实施方式
实施例1xa0植物双元表达载体的构建及转化农杆菌u3000u3000将来源于人的细胞色素P450２E1基因和来源于大肠杆菌的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-ECS）基因用限制性内切酶BamH1和Sac1酶切后，连接至植物双元转化载体pCAMBIA2301G，获得的重组表达载体命名为pCAMBIA2301G-p450-ECS。u3000u3000利用电穿孔法将重组表达载体pCAMBIA2301G-p450-ECS转化根瘤农杆菌菌株LBA4404。实施例2xa0植物转化u3000u3000采用农杆菌介导的叶盘转化法，将重组表达载体pCAMBIA2301G-p450-ECS转入紫花苜蓿叶片中。将过夜培养的带有pCAMBIA2301G-p450-ECS质粒的农杆菌培养液离心，菌体悬浮于10mlxa00.15mol/L的NaCL中，离心收集菌体，再悬浮于1mlxa020mmol/L的CaCL₂溶液悬浮，将紫花苜蓿叶片切成0.5X0.5cm的小块，放入含有pCAMBIA2301G-p450-ECS质粒的菌液中浸泡20min，用滤纸吸干多余的菌液，放在MS培养基上共培养3天，然后再转到含有卡那霉素的筛选培养基（MS+0.5mg/L6-BA十0.5mg/Lxa02,4-Dxa0+20xa0mg/Lxa0Kanamycin+300xa0mg/Lxa0Cefixime）上进行初步筛选。待芽长至1cm左右，将长芽的叶盘转移到生根培养基（MS+xa070xa0mg/Lxa0Kanamycinxa0+300xa0mg/Lxa0Cefixime）上诱导幼芽生根培养。待根系健壮后，将转化植株移栽到温室内培养，获得紫花苜蓿转化苗。实施例３u3000粉红粘帚霉－转基因紫花苜蓿系对铅－多环芳烃复合污染土壤的盆栽修复实验试验用直径40cm，高50cm塑料桶。为提高水的渗透性,xa0底部铺上5cm高的小石头,xa0然后装入干燥土壤。设置4组实验，包括3组种植实验，一组对照实验。种植实验组按3种实验条件种植，将相应植株苗种植于盆中。（1）未转基因的紫花苜蓿苗；（2）由实施例2得到的转基因紫花苜蓿苗；（3）由实施例2得到的转基因紫花苜蓿苗，苗根部区域施用粉红粘帚霉孢子粉剂，浓度达到10^3-5孢子/克土壤。（4）设空白对照盆组，不种紫花苜蓿。在试验初期植株成活后施加1次肥;xa0施加1次肥;xa0在植物生长过程中,xa0根据生长期施加1次肥。试验时间为半年。待植物成活后,xa0在土壤表面淋加含有重金属铅和多环芳烃溶液,使土壤中铅浓度为1000mg/kg;xa0多环芳烃为1000mg/kg。对这种复合污染浓度，未转基因的紫花苜蓿植株不能生长，枯萎。未加粉红粘帚霉孢子粉剂转基因紫花苜蓿生长受到明显抑制，施用粉红粘帚霉孢子粉剂的转基因紫花苜蓿植株生长良好。实验结束时，其植株干重仅为施用粉红粘帚霉孢子粉剂的转基因紫花苜蓿植株的1/3。可见，施用粉红粘帚霉孢子对转基因紫花苜蓿的耐受性有很大提高。同时，对植物的土壤修复能力也有很大提高。生长6个月后，检测土壤中重金属和多环芳烃浓度。表1给出了实验结束时不同实验的土壤中污染物的浓度，为了使数据直观，便于比较，表中采用了相对浓度，即以空白对照实验组的土壤的浓度为100％，其他浓度为与空白组浓度的相对比值。由表1可见，由于转基因紫花苜蓿的修复作用，土壤中的铅和多环芳烃均大幅度下降，但是，施用粉红粘帚霉孢子粉剂的实验组，由于粉红粘帚霉－转基因紫花苜蓿体系的高效修复作用，土壤中的铅和多环芳烃降低更多。我们将修复效率增加率定义为施用粉红粘帚霉孢子粉剂的转基因植株即粉红粘帚霉－转基因紫花苜蓿体系修复能力与未施用粉红粘帚霉孢子粉剂的转基因植株或非转基因植株修复能力的比值，修复能力用（100-修复后土壤相对浓度）表示，即由于修复作用减少的污染物量，即修复前后的浓度差。ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="554"/>ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="554"/>修复效率增加率＝（100-修复后土壤相对浓度1）/（100-修复后土壤相对浓度2）×100％式中，修复后土壤相对浓度1为经转基因植物－粉红粘帚霉体系修复后土壤中的相对铅或多环芳烃浓度，修复后土壤相对浓度2为用未施用粉红粘帚霉孢子粉剂的转基因植株或非转基因植株修复后土壤中的相对铅或多环芳烃浓度。由表2可见，粉红粘帚霉－转基因紫花苜蓿体系即施用粉红粘帚霉孢子的转基因紫花苜蓿的修复能力远远大于没有施用粉红粘帚霉孢子的转基因紫花苜蓿的修复能力，其中苗根部区域施用粉红粘帚霉形成的粉红粘帚霉－转基因紫花苜蓿体系?对铅的修复效率增加率达到304％，多环芳烃的修复效率增加率达到231％，取得了意想不到的显著效果。xa0实施例xa04xa0粉红粘帚霉－转基因紫花苜蓿体系对铅－多环芳烃复合污染土壤的盆栽修复实验，拌种实验由实施例2得到的转基因紫花苜蓿苗，正常生长，收获种子。种植其种子，用粉红粘帚霉孢子粉剂拌种，拌种粉剂浓度为10^3-5孢子/克，然后播种。待植物出苗后,xa0在土壤表面淋加含有重金属铅和多环芳烃溶液,使土壤中铅浓度为1000mg/kg；多环芳烃为1000mg/kg。其他栽培管理同实施例3。生长6个月后，检测土壤中重金属和多环芳烃浓度，检测结果见表1。由表2可见，按拌种法施用粉红粘帚霉孢子的转基因紫花苜蓿即粉红粘帚霉－转基因紫花苜蓿体系?I的修复能力与苗根部区域施用粉红粘帚霉孢子的转基因紫花苜蓿即粉红粘帚霉－转基因紫花苜蓿体系?的基本相同，也远远大于没有施用粉红粘帚霉孢子的转基因紫花苜蓿的修复能力，其中铅的修复效率增加率达到300％，多环芳烃的修复效率增加率达到228％，取得了很好的修复效果。实施例xa05xa0粉红粘帚霉－转基因紫花苜蓿体系及非转基因紫花苜蓿对铅－多环芳烃复合污染土壤的盆栽修复对比实验本发明还用非转基因的紫花苜蓿进行了对比实验，实验方法同实施例3、实施例4，实验结果见表1和表2。结果表明，粉红粘帚霉－转基因紫花苜蓿体系?、粉红粘帚霉－转基因紫花苜蓿体系?I，相对于非转基因的紫花苜蓿（不施用粉红粘帚霉的野生紫花苜蓿），对铅或者多环芳烃的修复效率增加率达到683-878％，效果非常显著。本发明可以较好的修复复合污染土壤，所以，也可以更好的修复单一污染的土壤。